Hepburn và Spencer Tracy

Hepburn đóng cùng Spencer Tracy lần đầu tiên trong bộ phim Woman of the Year (1942). Đằng sau màn ảnh hai người yêu nhau và trở thành một trong những cặp đôi nổi tiếng nhất của màn bạc, Hepburn, với trí thông minh và giọng thổ âm New England đặc biệt của mình, đã kết hợp hài hoà cho vẻ nam tính dễ dãi của Tracy. Khi Joseph Mankiewicz giới thiệu hai người với nhau, Hepburn, vốn có dáng người cao lại đi giày cao gót, nói: "Tôi sợ rằng tôi quá cao để đóng với ông, thưa ông Tracy", Mankiewicz vặn lại: "Cô đừng lo, anh ta sẽ hạ cô xuống cho vừa".

Hai người đã đóng chung 9 bộ phim, trong đó có Adam's Rib (1949), Pat and Mike (1952) và Guess Who's Coming to Dinner (1967), với bộ phim thứ ba Hepburn đã mang về giải Oscar thứ hai cho mình.

Hai người cố gắng che giấu mối quan hệ của họ trước dư luận, họ đến trường quay bằng cửa sau và tránh giáp mặt giới báo chí. Hepburn và Tracy rõ ràng đã là một đôi trong nhiều thập kỷ, nhưng họ lại chưa bao giờ sống chung liên tục cho đến mãi những năm cuối đời của Tracy. Trước khi gặp Tracy, Hepburn đã có quan hệ với vài đạo diễn và những nhân vật của Hollywood, bà còn quan hệ với cả tỷ phú, phi công nổi tiếng Howard Hughes. Tuy nhiên Tracy có lẽ vẫn là tình yêu đích thực duy nhất của Hepburn, bà đã bỏ đóng phim 5 năm kể từ sau Long Day's Journey Into Night (1962) để chăm sóc Tracy khi ông bắt đầu yếu đi. Không được gia đình Tracy chấp nhận, bà đã không tới dự lễ tang của ông. Hepburn thổ lộ rằng bà gần như không thể xem bộ phim Guess Who's Coming to Dinner được nữa vì việc nhớ lại những kỷ niệm về Tracy là quá sức chịu đựng.